Viešųjų duomenų analizė
Duomenys apie SARS-CoV-2 linijas ir data, kai mėginys buvo paimtas iš sekų, gautų iš Čilės, buvo gauti iš „Consorcio Genomas CoV2“ svetainės, esančios adresu https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Skiepijimo duomenys buvo gauti iš viešų mokslo, technologijų, žinių ir inovacijų ministerijos duomenų, kuriuos galima rasti adresu https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (83 produktas).
Infekcijos tyrimas
Pseudotipiniai virusai, turintys skirtingus SARS-CoV-2 smaigalio baltymus, buvo paruošti, kaip aprašėme anksčiau12. Trumpai tariant, ŽIV-1 pagrindu pagaminti SARS-CoV-2 pseudotipai buvo pagaminti HEK293T ląstelėse, transfekuojant pNL4.3-ΔEnv-Luc kartu su atitinkamu pCDNA-SARS-CoV-2 Spike kodavimo vektoriumi 1: 1 moliniu santykiu. Plazmidės, koduojančios kodonui optimizuotą smaigalį, kuriame nėra paskutinių 19 C-galo galo aminorūgščių (SΔ19), žinoma, kad išvengiama sulaikymo endoplazminiame tinklelyje12 buvo gauti naudojant genų sintezę arba pritaikytą į vietą nukreiptą mutagenezę („GeneScript“) ir juose buvo šios mutacijos: A linija (etaloninė seka), B linija (D614G), B.1.1.7 linija (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), linija P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) ir linija C.37 (G75V, T76I, 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Kiekvienas pseudotipo preparatas buvo išvalytas centrifuguojant 859 aps./min. Kambario temperatūroje, kiekybiškai įvertintas naudojant ŽIV-3,000 „Gag p1 Quantikine ELISA Kit“ (R&D Systems), alikvotą 24% galvijų vaisiaus serume („Sigma-Aldrich“) ir laikomas -50 ° C temperatūroje iki naudoti. HEK-ACE80 ląstelėms užkrėsti buvo naudojami skirtingi pseudotipų virusų kiekiai (nustatyti pagal ŽIV-1 p24 baltymo kiekį), o po 2 valandų ugniažolės luciferazės aktyvumas buvo išmatuotas naudojant „Luciferase Assay Reagent“ („Promega“) Glomax 48 mikroplokštelėje. Luminometras (Promega).
Neutralizacijos tyrimas
Pseudotipiniai virusų neutralizavimo tyrimai buvo atlikti iš esmės, kaip aprašėme anksčiau12. Trumpai tariant, serijiniai plazmos mėginių praskiedimai (nuo 1: 4 iki 1: 8748) buvo paruošti DMEM su 10% galvijų vaisiaus serumu ir inkubuoti su 5 ng kiekvieno pseudotipinio viruso p24 1 valandą 37 ° C temperatūroje, o po to 1 × 104 HEK-ACE2 ląstelių buvo pridėta prie kiekvieno šulinio. HEK293T ląstelės (neišreiškiančios ACE2), inkubuotos su pseudotipiniu virusu (A linija), buvo naudojamos kaip neigiama kontrolė. Ląstelės lizuojamos po 48 valandų, o ugniažolės luciferazės aktyvumas buvo išmatuotas naudojant „Luciferase Assay Reagent“ („Promega“) „Glomax 96 Microplate“ luminometre („Promega“). Apskaičiuotas kiekvieno praskiedimo neutralizavimo procentas ir kiekvieno mėginio ID50 apskaičiuotas naudojant „GraphPad Prism“ 9.0.1 versiją.
Statistinės analizės
Statistinė analizė atlikta naudojant „GraphPad Prism“ programinės įrangos 9.1.2 versiją. Keli grupių palyginimai, skirti neutralizuoti antikūnų titrus (NAbT) su SARS-CoV-2 pseudotipų virusų grupe, taip pat NAb atsakų lyginimas pagal lytį ir dūmų būklę buvo atlikti naudojant suporuotą Wilcoxon pasirašytą testą. Faktoriaus pokytis buvo apskaičiuotas kaip geometrinio vidurkio titro skirtumas ID50 palyginti su laukinio tipo pseudotipiniu virusu. Koreliacijos tarp NAbT ir amžiaus ar KMI analizė buvo atlikta naudojant Spearmano testą. Buvo atliktas vienpusis ANOVA ir „Tukey“ daugybinis palyginimo testas, skirtas statistinei infekcijos analizei. P vertė ≤0.05 buvo laikoma statistiškai reikšminga.
Etinis patvirtinimas
Studijų protokolą patvirtino Čilės Universiteto Medicinos fakulteto Etikos komitetas (projektai Nr. 0361-2021 ir Nr. 096-2020) ir „Clínica Santa Maria“ (projektas Nr. 132604-21). Visi donorai pasirašė informuotą sutikimą, o jų mėginiai buvo anonimiški.
„Lambda“ varianto smaigalių mutacijų poveikis užkrečiamumui ir neutralizuojančių antikūnų reakcijoms
Birželio 3695 d. GISAID deponuota 24 Čilės sekų analizėth 2021 m. Akivaizdus SARS-CoV-2 variantų „Gamma“ ir „Lambda“ dominavimas per paskutinį trimestrą, 79% visų sekų.
Įdomu tai, kad šiam laikotarpiui buvo būdinga didžiulė skiepijimo kampanija, kurios metu 65.6% tikslinės populiacijos (18 metų ir vyresni asmenys) gavo visą skiepijimo schemą pagal birželio 27 d.th 2021
Atsižvelgiant į tai, kad 78.2% žmonių, skiepytų visa schema, gavo Sinovac Biotech inaktyvuotą vakciną nuo koronaviruso CoronaVac, siekėme ištirti Lambda variante esančių smaigalių mutacijų poveikį šios vakcinos sukeltų antikūnų neutralizavimo gebėjimui.
Tam mes sukūrėme ŽIV-1 pagrindu pagamintus SARS-CoV-2 pseudotipinius virusus, turinčius smaigalinį baltymą iš Wuhan-1 etaloninės linijos (laukinis tipas; A linija), D614G mutaciją (B linija) ir Alfa (B linija) .1.1.7), gama (linija P.1) ir lambda (linija C.37).
Ruošiant virusą, mes nuolat stebėjome, kad ląstelės, užkrėstos pseudotipiniu virusu, turinčiu Lambda smaigalį, sukėlė žymiai aukštesnes bioliuminescencijos vertes, palyginti su D614G mutantu arba alfa ir gama variantais, rodančiais padidėjusį užkrečiamumą, kurį sukelia Lambda smaigalio baltymas
1 pav.Infekcija, kurią sukelia įvairūs baltymai.
(A) Scheminis SARS-CoV-2 smaigalio baltymo ir šiame tyrime naudojamų variantų pavaizdavimas. Skliausteliuose nurodytos linijos. UBR, receptorių surišimo domenas, CM; citoplazminė uodega.
(B) Kiekvienos linijos pseudotipų titravimas naudojant lygiaverčius ŽIV-1 p24 kiekius. Ugniagesio luciferazės aktyvumas buvo matuojamas kaip santykinis liuminescencijos vienetas (RLU) praėjus 48 valandoms po infekcijos. Vidutinis ir SD buvo apskaičiuoti iš tipiško trijų bandymų.
Toliau neutralizavimo tyrimams atlikti panaudojome aukščiau minėtus pseudotipinius virusus, naudodami 79 plazmos mėginius iš sveikų sveikatos priežiūros darbuotojų iš Universidad de Chile ir Clínica Santa María Santjage, Čilėje.
Mes neįtraukėme 4 mėginių, nes negalėjome apskaičiuoti ID50 titro. Iš tirtų mėginių 73% atitiko moteris, amžiaus vidurkis - 34 metai (IQR 29 - 43), o kūno maksimalus indeksas (KMI) - 25 (IQR 22.7 - 27). 20.5% dalyvių pareiškė, kad yra aktyvūs rūkaliai, kol tęsiasi imunizacijos laikotarpis. Mėginiai buvo paimti vidutiniškai 95 dienas (IQR 76–96) po antrosios vakcinos „CoronaVac“ dozės
Pastebėjome, kad neutralizavus pseudotipinį virusą, nešantį laukinio tipo smaigalio baltymą, 50% slopinamasis atskiedimas (ID50) vidutinis titras 191.46 (154.9 - 227.95, 95% PI,), tuo tarpu jis buvo 153.92 (115.68 - 192.16, 95% PI), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% PI), 104.57 (75.02 - 134.11, 95% PI) ) ir 78.75 (49.8 - 107.6, 95% PI) pseudotipiniams virusams, turintiems dygliuotą baltymą iš atitinkamai D614G mutanto arba alfa, gama ir lambda variantų.
Mes taip pat pastebėjome, kad geometrinis vidutinis ID titras50 titrai sumažėjo 3.05 (2.57 - 3.61, 95% PI) pseudotipinio viruso, nešiojančio Lambda smaigalį, ir 2.33 (1.95 - 2.80, 95% PI) gama smaigalio, 2.03 (1.71 - 2.41, 95% PI) „Alpha“ smaigaliui ir 1.37 (1.20 - 1.55, 95% PI) D614G smailiui, palyginti su „Wild“ tipo smaigaliu.
Mūsų tyrimo grupėje nepastebėta koreliacijos tarp lyties, amžiaus, kūno masės indekso (KMI) ar dūmų būklės ir neutralizuojančių antikūnų titrų.
2 pav.Neutralizacijos tyrimas, naudojant plazmos mėginius iš skiepytų „CoronaVac“
(A) Abipusio 50% neutralizavimo titro pokyčiai (ID50) plazmos mėginiuose iš 75 recipientų, gavusių „CoronaVac“ vakciną nuo D614G (B linija), Alfa (B.1.1.7 linija),
Gama (linija P.1) ir lambda (linija C.37), palyginti su laukinio tipo virusu. Rezultatai rodomi kaip suderintų mėginių neutralizavimo titrų skirtumas. P reikšmės ID palyginimui50 yra apskaičiuojami pagal Wilcoxon pasirašyto rango testą.
(B) Dėžutės sklypai nurodė ID vidurkį ir tarpkvartilinį diapazoną (IQR)50 kiekvienam pseudotipiniam virusui. Faktorių pokyčiai rodomi kaip geometrinio vidurkio titro skirtumas ID50 palyginti su laukinio tipo pseudotipo virusu. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant Wilcoxon suderintų porų pasirašyto rango testą.
Kartu mūsų duomenys atskleidė, kad naujai pripažinto dominančio varianto „Lambda“ smaigalinis baltymas, labai cirkuliuojantis Čilėje ir Pietų Amerikos šalyse, turi mutacijų, suteikiančių didesnį užkrečiamumą ir galimybę išvengti „CoronaVac“ sukeltų neutralizuojančių antikūnų.
